GeneAce Reverse Transcriptase

M-MLV由来の逆転写酵素　改変型（RNase H－）

品名	Code No.	包装単位	価格	備考
GeneAce Reverse Transcriptase	316-08151	10,000 units	20,000円
GeneAce Reverse Transcriptase	312-08153	10,000 units x 5	80,000円

製造元　（株）ニッポンジーン

表示価格は希望納入価格 (税別) です。

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製品説明

本品は、Moloney Murine Leukemia Virus（M-MLV；マウス白血病ウイルス）由来の改変型（RNase H－）の逆転写酵素で、大腸菌で発現・精製した組換え酵素です。改変型は点変異によりRNase H活性を欠損させています。RNase H 活性はDNA- RNAハイブリッド二本鎖のRNAを分解する活性で、RNase H 活性を欠損させることで完全長cDNAの合成効率が向上します。

※ M-MLV由来の野生型（RNase H+）の逆転写酵素 M-MLV Reverse Transcriptase はこちら

特長

・M-MLV由来の改変型（RNase H－）逆転写酵素・完全長cDNAの合成効率が向上・熱安定性が向上・高温反応によりRNAの二次構造による影響を回避・GeneAce qPCR Mix α（リアルタイムqPCR試薬）との組み合わせに最適

用途

First strand cDNA 合成
RT-PCR

起源	遺伝子組換え大腸菌
活性	200 units/µl
単位の定義	1 unit は、37°Cで10 分間に1 nmol のdTTPを酸不溶性画分に取り込ませる酵素活性とする。
形状	GeneAce Reverse Transcriptase： 20 mM Tris-HCl (pH7.5), 200 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% Glycerol, 0.05% NP-40, 0.05% Tween20 5 x RT Buffer： 250 mM Tris-HCl (pH8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT

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製品内容

GeneAce Reverse Transcriptase（10,000 units）
構成品	容量	保存	備考
GeneAce Reverse Transcriptase	50 µl x 1	-20°C
5 x RT Buffer	1 ml x 1	-20°C	5 x RT Buffer に白い沈澱が析出している場合は、室温でボルテックスミキサー等で混和し、完全に均一にしてからご使用ください。

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使用例

実験例1　cDNA合成効率の比較

マウスFM3A細胞 total RNA 2 µgを鋳型として、Oligo (dT) primerとGeneAce Reverse Transcriptase、A社製品、B社製品（各社RNaseH－改変型）を用いてそれぞれ逆転写反応を行った。その後、合成したcDNAを鋳型にして、GeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROXを用いて定量PCRを行った。
合成した各cDNAを鋳型として定量PCRによりβ-actin遺伝子を検出し、増幅の立ち上がりの早さを比較した。

結果

GeneAce Reverse Transcriptaseで合成したcDNAは、増幅曲線の立ち上がりが早く、cDNAの合成効率が高いことが示された。

実験例2　長鎖cDNA（10 kb）の合成効率の比較

マウスFM3A細胞 total RNA 2 µgを鋳型として、Oligo (dT) primerとGeneAce Reverse Transcriptase、A社製品、B社製品（各社RNaseH－改変型）を用いてそれぞれ逆転写反応を行った。その後、合成したcDNAを鋳型にして、GeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROXを用いて定量PCRを行った。
合成したcDNAを鋳型に、Utrophin遺伝子（NM_011682, 12382 bp）を定量PCRによりcDNA量を比較した。定量PCR primerは3’末端から約10 kb付近に設計した。

結果

GeneAce Reverse Transcriptaseは、約10 kbpの長鎖cDNAの合成効率が高いことが示された。

実験例3　長鎖cDNA（10 kb）の合成　（実際の反応例）

Total RNAの抽出→逆転写反応→リアルタイムPCR

ISOSPIN Cell & Tissue RNA を使用して、マウス腎臓組織 9.1 mg から total RNA 15 μg を抽出した。
得られた total RNA 2 μgを鋳型に GeneAce Reverse Transcriptase を用いて 1st strand cDNA を合成した。
cDNA溶液を鋳型に、Utrophin mRNA の3'側から約10 kb の領域を増幅するプライマーを用いてリアルタイムPCRを行った（GeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROXを使用）。

逆転写反応系
↓　RNA変性：　65°C　5分、On ice
50 μM Oligo dT(20) Pirmer	1 µl
10 mM dNTPs	1 µl
total RNA + ddH2O	up to 15µl
5 X RT Buffer	4 µl
GeneAce Reverse Transcriptase	1 µl
↓　逆転写反応：　42°C　50分 ↓　熱失活：　70°C　15分
1st strand cDNA 溶液	（反応液量　20 μl）