ISOGEN、ISOGEN-LS

RNA抽出用試薬

ISOGENを用いた骨からのRNA抽出

ISOGENを用いて下記のプロトコルでRat脊椎からのtotal RNA抽出を試み、得られたtotal RNAの収量と純度を測定しました。

プロトコール

Ratから脊椎を摘出し、付着している筋肉を、手早く、できるだけ除去した *1
↓  
脊椎を液体窒素中で磨砕
↓  
粉末状組織 0.5 g
↓ ←ISOGEN 5 ml
ポリトロンでホモジナイズ
↓  
静置（室温、5分）*2
↓ ←クロロホルム 2 ml
強く混合（2分）
↓  
静置（室温、3分）
↓  
遠心分離（5,000 rpm、4°C、15分）
↓  
上清を各サンプル 2.5 mlずつ回収
↓ ←イソプロパノール 2.5 ml *3
静置（室温、10分）
↓  
遠心分離（5,000 rpm、4°C、10分）
↓  
上清を除去
↓  
75% エタノールで洗浄（2回）
↓  
ddH2Oに溶解
↓  
エタノール沈澱
↓  
75% エタノールで洗浄（2回）
↓  
ddH2O 300 µlに溶解

 

*1 完全には除去できず、わずかに筋肉が残った。

*2 室温5分間の静置を「静置（室温、30分）→遠心分離（5,000 rpm、4°C、10分）→上清を回収」に変更した場合も、結果に大きな違いは生じなかった。

*3 イソプロパノール 2.5 mlの代わりに、イソプロパノール 1.25 mlとHigh Salt Precipitation Solution 1.25 mlを添加した場合も、結果に大きな違いは生じなかった。High Salt Precipitation Solutionを加えたサンプルの中には、イソプロパノール沈殿後に結晶化してしまうものがあった。結晶は75% エタノールでの2回の洗浄では除けなかったが、ddH2Oに溶解し、再度エタノール沈殿を行うことで見えなくなった。

 

結果

上記のプロトコールで抽出したRNA溶液1 µl を50mM Tris-HCl （pH8.0） 99 µl で希釈し、吸光度を測定した。　

OD260
OD280
OD260/280
収量（µg）
0.3878
0.1744
2.2241
466

 

 

 


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